15分鐘出結(jié)果！支原體快檢試劑盒使用全指南（含避坑要點）?  

支原體污染是細胞培養(yǎng)中的“隱形殺手”，會導(dǎo)致細胞生長緩慢、功能異常，甚至實驗數(shù)據(jù)無效。支原體快檢試劑盒憑借“快速（10-15分鐘）、靈敏（檢測限≤10CFU/mL）、操作簡便”的優(yōu)勢，成為科研實驗室日常質(zhì)控的核心工具。為確保檢測結(jié)果精準，需嚴格遵循以下使用須知：?  

一、檢測前：做好3項核心準備（避免基礎(chǔ)失誤）?  

1.樣本準備：選對樣本類型，確保濃度適配?  

適用樣本：僅用于“細胞培養(yǎng)上清液”“細胞裂解液”或“病毒收獲液”，不適用全血、組織勻漿等復(fù)雜樣本（復(fù)雜樣本中的蛋白、雜質(zhì)會干擾檢測反應(yīng)）；?  

樣本要求：?  

細胞上清液：需收集“對數(shù)生長期細胞的上清”（細胞匯合度70%-80%，避免細胞凋亡釋放的核酸污染），無需離心（輕微沉淀不影響檢測，劇烈離心可能丟失支原體）；?  

樣本濃度：若細胞密度過低（＜1×10?cells/mL），需先將上清液“5000rpm離心10分鐘”，取沉淀用試劑盒配套的“樣本稀釋液”重懸（提升支原體濃度，避免假陰性）；?  

禁忌：樣本不可用“含抗生素的培養(yǎng)基”（如青霉素、鏈霉素會抑制支原體活性，導(dǎo)致檢測信號減弱），若培養(yǎng)基含抗生素，需更換無抗培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后再取樣。?  

2.試劑準備：檢查狀態(tài)，平衡溫度?  

試劑完整性：打開試劑盒后，確認“檢測卡（含反應(yīng)區(qū)）、樣本稀釋液、陽性對照、陰性對照”4類試劑齊全，且無漏液、變質(zhì)（如檢測卡反應(yīng)區(qū)變色、稀釋液渾濁，需立即更換）；?  

溫度平衡：所有試劑需從2-8℃冰箱取出后，在“室溫（20-25℃）放置15分鐘”再使用（低溫試劑會導(dǎo)致反應(yīng)速率變慢，延長檢測時間，甚至出現(xiàn)假陰性）；?  

避免污染：陽性對照需單獨存放（用醒目標簽標注），取用時使用專用移液器吸頭，避免交叉污染樣本或陰性對照（否則會導(dǎo)致假陽性）。?  

3.環(huán)境與工具準備：控制干擾因素?  

環(huán)境要求：在“無風、潔凈的超凈臺或?qū)嶒炁_”操作，避免陽光直射（試劑盒中的熒光探針對強光敏感，直射會導(dǎo)致熒光淬滅，影響結(jié)果判讀）；?  

工具適配：需準備“100μL微量移液器（精度±2%）”“無菌離心管”“一次性手套”，移液器需提前校準（避免移液體積偏差導(dǎo)致檢測誤差），手套需全程佩戴（防止手部皮膚脫落的細胞、核酸污染樣本）。?  

二、檢測中：嚴格遵循4步操作流程（每步都有關(guān)鍵細節(jié)）?  

步驟1：樣本處理（僅需2分鐘，核心是“均勻混合”）?  

取“100μL待檢測樣本”加入到“樣本稀釋管”中，用移液器反復(fù)吹吸5次（確保樣本與稀釋液充分混合，避免局部濃度不均）；?  

若樣本為“細胞裂解液”，需先加入試劑盒配套的“蛋白酶K”（10μL/管），37℃孵育5分鐘（降解細胞蛋白，釋放支原體核酸，提升檢測靈敏度），再加入稀釋液。?  

步驟2：加樣反應(yīng)（關(guān)鍵是“加樣量準確，避免溢出”）?  

用移液器吸取“50μL處理后的樣本”，垂直滴加至檢測卡的“加樣孔”中（不可滴加在反應(yīng)區(qū)，加樣量需精準，過多會導(dǎo)致液體溢出污染反應(yīng)線，過少會導(dǎo)致反應(yīng)不充分）；?  

加樣后立即計時，室溫靜置10-15分鐘（不可超過20分鐘，超時會導(dǎo)致反應(yīng)線擴散，無法判讀結(jié)果），期間不可晃動檢測卡（晃動會破壞反應(yīng)區(qū)的層析過程）。?  

步驟3：陽性/陰性對照同步檢測（必須做，排除試劑盒問題）?  

陽性對照：取“100μL陽性對照液”，按“步驟1-2”同步操作（若陽性對照無檢測線，說明試劑盒失效，需更換新試劑盒）；?  

陰性對照：取“100μL陰性對照液”（通常為無支原體的細胞培養(yǎng)基），同步操作（若陰性對照出現(xiàn)檢測線，說明存在交叉污染，需重新取樣檢測）。?  

步驟4：結(jié)果判讀（15分鐘準時判讀，超過時間無效）?  

判讀標準：檢測卡含“質(zhì)控線（C線）”和“檢測線（T線）”，僅C線顯色為陰性（樣本無支原體污染），C線+T線均顯色為陽性（樣本含支原體），無C線顯色為無效（需重新檢測）；?  

特殊情況：若T線顯色“微弱但可見”（需在白色背景下觀察），判定為“弱陽性”（提示支原體低濃度污染，建議3天后重新取樣檢測，或更換高靈敏度試劑盒確認）。?  

三、檢測后：做好3項收尾工作（保障后續(xù)實驗與安全）?  

1.結(jié)果記錄：詳細標注，便于追溯?  

記錄內(nèi)容：需填寫“檢測日期、樣本名稱（如HeLa細胞第5代上清）、檢測時間、結(jié)果（陰性/陽性/弱陽性）、操作人員”，若為陽性，需補充“細胞培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度）”，便于分析污染來源；?  

保存方式：檢測卡需用密封袋封裝后，與記錄單一起存放（2-8℃可保存7天，用于后續(xù)復(fù)查或比對）。?  

2.試劑處理：分類丟棄，避免污染?  

廢棄試劑：陽性對照、樣本稀釋管、移液器吸頭需放入“生物安全垃圾袋”，高溫滅菌（121℃，30分鐘）后丟棄（支原體有傳染性，避免環(huán)境擴散）；?  

剩余試劑：未用完的檢測卡需放回原試劑盒，密封后2-8℃保存（避免反復(fù)凍融，保質(zhì)期內(nèi)使用，過期試劑不可再用）。?  

3.環(huán)境清潔：消除殘留，防止交叉污染?  

實驗臺面：用“75%乙醇擦拭”（支原體對乙醇敏感，可有效殺滅），超凈臺需開啟紫外燈照射30分鐘（消毒臺面和空氣）；?  

移液器：若操作中不慎污染，需用“移液器專用消毒濕巾”擦拭槍頭推桿和吸頭座，避免后續(xù)樣本污染。?  

四、避坑指南：5個常見錯誤及解決辦法?  

假陰性：樣本中支原體濃度過低?  

錯誤原因：未離心濃縮樣本，或樣本取自“靜止期細胞”（支原體主要存在于對數(shù)期細胞上清）；?  

解決：下次取樣前，將細胞傳代至對數(shù)期（匯合度70%），上清液5000rpm離心10分鐘后檢測。?  

假陽性：操作中交叉污染?  

錯誤原因：陽性對照與樣本共用移液器吸頭，或檢測卡加樣后被陽性樣本污染；?  

解決：陽性對照需單獨使用一套移液器和吸頭，加樣后立即蓋上檢測卡蓋子，避免液體飛濺。?  

無效結(jié)果：加樣量不足或檢測卡過期?  

錯誤原因：加樣量＜50μL（反應(yīng)不充分），或檢測卡超過保質(zhì)期（試劑活性下降）；?  

解決：嚴格按說明書控制加樣量，使用前核對試劑盒保質(zhì)期（通常為12個月，開封后3個月內(nèi)用完）。?  

結(jié)果誤判：超時觀察或強光下判讀?  

錯誤原因：超過20分鐘判讀（T線擴散消失），或在陽光直射下觀察（熒光信號被掩蓋）；?  

解決：15分鐘準時判讀，在白色背景燈或自然光下觀察（避免強光）。?  

試劑變質(zhì)：未平衡溫度直接使用?  

錯誤原因：低溫試劑直接加樣，導(dǎo)致反應(yīng)區(qū)層析受阻；?  

解決：試劑需室溫平衡15分鐘，觸摸試劑管外壁無冰涼感后再使用。?  

五、適用范圍與局限性：明確使用邊界?  

適用場景：僅用于“科研實驗室細胞培養(yǎng)的支原體質(zhì)控”，不用于臨床診斷（如人體支原體檢測）；?  

不適用情況：樣本含“高濃度蛋白（如血清濃度＞20%）”“強還原劑（如β-巰基乙醇）”時，會抑制檢測反應(yīng)，需先用“蛋白去除試劑盒”預(yù)處理樣本后再檢測。?