和PCR比起來，qPCR不用跑膠，實時監(jiān)測擴增狀況，操作更為便捷。下面以德國MB Venor®GeM支原體檢測試劑盒（qPCR一步法）（Venor®GeM qOneStep）為例，略述檢測原理和過程。

   該試劑盒包括4管試劑，其中2管分別為緩沖液和PCR水，另2管為主要試劑。1管即mix，含引物、核苷酸、聚合酶、熒光素標(biāo)記的探針和內(nèi)部擴增對照。另1管為陽性對照，均為凍干粉。

它通過擴增高度保守的rRNA操縱子，或者更準(zhǔn)確地說，擴增支原體基因組中的16S rRNA編碼區(qū)，可以特異性地檢測支原體。在520nm（FAMTM通道）檢測支原體特異性擴增片段。在610nm（HEXTM通道）檢測內(nèi)部擴增對照的擴增。它能特異性檢測所有導(dǎo)致細(xì)胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會被擴增。通過內(nèi)部對照，可檢測PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結(jié)果。樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。檢測程序可在3小時內(nèi)完成。

在檢測前，樣本需要一定的制備。具體是將100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 ml反應(yīng)管中。關(guān)上蓋子扣緊。將樣品在95°C下孵育5分鐘。以大速度短暫離心樣品（15秒）以沉淀任何細(xì)胞碎片。然后可直接取2μl上清液進行qPCR。

qPCR反應(yīng)體系一共是25ul，其中樣本2ul，其余是master mix。注意設(shè)置陽性對照、陰性對照（無模板對照）。

如果檢測的Ct<40，則表明PCR結(jié)果陽性。如果檢測的Ct≥40，則PCR反應(yīng)結(jié)果為陰性。如果FAM陽性，則支原體陽性。如果FAM陰性，HEX也陰性，表明PCR擴增出了問題，需要重做。如果FAM陰性，HEX陽性，表明支原體確實陰性。

PCR擴增出了問題主要原因為PCR反應(yīng)被抑制了，可能需要考慮做DNA抽提。

在qPCR反應(yīng)中，引物和探針的設(shè)計尤為重要，它既需要覆蓋大多數(shù)支原體，又需要不與細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然，Taq酶的性能也很重要，因為DNA的擴增終依賴于酶的活性和擴增的速度。從這個角度說，一個好的qPCR試劑盒是各個因素共同作用的結(jié)果。